近年来，液体活检因其低侵入性和可实现频繁或连续采样，受到广泛关注。这种技术能够持续跟踪肿瘤进展及治疗反馈。细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EV）则是一种由细胞释放的膜结构，含有脂质、蛋白质和RNA等多种成分，能够真实反映活体细胞状态，逐渐成为生物标志物研究的重点。有研究表明，EV中miRNA生物标志物的诊断性能普遍优于单一生物标志物，且在血浆中其诊断价值略高于血清。针对前列腺癌，研究发现10种尿液miRNA可作为早期检测工具。此外，有关EV长链RNA的研究显示，血液中EV的长链RNA表达谱能够有效区分健康者与胰腺导管腺癌患者。

传统研究多采用短读长测序技术分析cfRNA，但由于这一方法读长较短，解析全长转录本异构体和复杂RNA加工事件的能力非常有限。相比之下，cfRNA中细胞外囊泡RNA的完整性更佳、长度更长，因此利用长读长RNA测序技术直接对EV RNA进行全长转录本测序，有望发现更多新型RNA异构体，从而实现更高效、准确的临床应用价值。来自美国加州大学圣克鲁兹的Daniel Kim研究小组认识到长读长测序的优势，开始聚焦于血液EV RNA的检测，验证其在疾病诊断中的潜在作用。他们发现，基于DNA的液体活检方法可能会错过癌症早期阶段，早期诊断能促进及时治疗并降低死亡率。

该研究小组利用COMPLETE-seq RNA流程，从血浆中提取EV RNA，采用高特异性的膜亲和材料和硅胶膜柱法进行处理。他们结合纳米孔长读长技术与短读长技术进行测序，从而全面了解EV RNA转录组。研究结果指出，重复RNA序列在血液中数量丰厚，能够作为特定疾病的诊断生物标志物，其成果已在Nature Biomedical Engineering期刊发表。COMPLETE-seq RNA流程中，首先从血浆中提取EV RNA，并将其反转录为cDNA以进行文库准备，接着进行短读长和长读长测序，最后分析基因差异表达和cfRNA长度。分析结果显示，所有胰腺癌患者样本中都有大量来自重复序列的游离RNA，大部分来源于SINE元件。

研究小组还利用癌症基因组图谱（TCGA）中食道癌的测序数据和GTEx联盟的健康样本来挖掘癌症特异性食道RNA特征，发现数百个重复衍生转录本在食道癌中高度特异性富集，表明重复RNA序列具有作为疾病特异性诊断生物标志物的潜力。以往研究认为血浆cfRNA多为短且降解，而该研究小组通过全长cDNA纳米孔测序，对比胰腺癌患者与对照组的cfRNA，结果显示与传统观点截然不同。这项研究显示的长读长测序数据揭示了mRNA长度可达1,337 nt（中位数456 nt）、lncRNA 970 nt（中位数303 nt）、LINE 1,002 nt（中位数258 nt）及SINE 368 nt（中位数185 nt）等，说明纳米孔长读长测序技术揭示了长链、多腺苷酸化的RNA分子的存在，其中不仅包括lncRNA。

该研究中，健康对照与胰腺癌患者的血液样本经过分离、处理和提取，结果表明采用exoRNeasy（QIAGEN）试剂盒提取得到的EV RNA具有高完整性，无降解发生。exoRNeasy系列试剂盒能够支持高达4 mL的血清/血浆、16 mL尿液和32 mL细胞培养上清的处理。这一高效的细胞外囊泡RNA分离方案可直接在柱上完成裂解，结合QIAGEN经典的硅胶膜技术有效提取高纯度总RNA，适用于包括mRNA、长链非编码RNA和miRNA在内的多种小RNA检测分析。若仅需分离EV，可选择exoEasy MaxiKit，无需超速离心或沉淀，仅需25分钟即可完成细胞外囊泡特异性分离。

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